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24 Febrero 2020

Biopsias líquidas de alta precisión

La identificación precisa de las variantes somáticas derivadas de tumores en el ADN libre de células y circulante en plasma (ADNlc) requiere la comprensión de los diversos compartimentos biológicos que contribuyen al conjunto de este tipo de material genético. Actualmente, se ha buscado definir la factibilidad técnica de un ensayo de secuenciación de este ADNlc con biopsias de tejido tumoral para mejorar la sensibilidad y especificidad, permitiendo la detección de novo de mutaciones derivadas del tumor. Dado que la gran mayoría de las mutaciones en el ADNlc tienen características consistentes con la hematopoyesis clonal, el enfoque de secuenciación enfatiza la importancia de analizar en paralelo las mutaciones somáticas no vinculadas al tumor en sí, sino que aquellas vinculadas al envejecimiento de glóbulos blancos. De esta forma, discriminar las mutaciones relacionadas con el cáncer de aquellas provenientes de la hematopoyesis clonal, un paso obligatorio hacia la implementación de la biopsia líquida en la práctica clínica de rutina.


ADN libre circulante

En los últimos años se han desarrollado tecnologías capaces de detectar con precisión las alteraciones moleculares asociadas a los tumores sólidos en los fluidos corporales, un proceso denominado 'biopsia líquida'. En concreto, el análisis de muestras de plasma de sangre periférica en combinación con la secuenciación de nueva generación (NGS) se está incorporando gradualmente en el ámbito clínico debido a la accesibilidad, baja invasividad y coste decreciente de este procedimiento. Sin embargo, este enfoque no está exento de limitaciones, y éstas deben ser abordadas cuidadosamente para asegurar un perfil molecular preciso del tumor y las consiguientes decisiones terapéuticas correctas para el manejo de la enfermedad del paciente. La detección de mutaciones con alta sensibilidad-es decir, la capacidad de detectar una pequeña cantidad de copias mutadas en un contexto no mutado-permite la aplicación precisa de terapias dirigidas. Sin embargo, es importante asegurar que estas mutaciones se detecten con una capacidad adecuada para asignarlas como de origen tumoral y no como derivadas de otros tejidos. En este sentido, Razavi y sus colaboradores describen el perfil molecular de los tumores sólidos usando un método de secuenciación de biopsia líquida modificada. Encontraron que había algunas mutaciones somáticas que no estaban vinculadas al tumor en sí, sino que se debían al envejecimiento de los glóbulos blancos y que, por lo tanto, era necesario tenerlas en cuenta al analizar los datos (Nat Med. 2019 Dec;25(12):1928-1937).

El uso de biopsias líquidas para el perfil molecular de los tumores se basa en el hecho de que la sangre periférica contiene células tumorales viables y ácidos nucleicos circulantes del tumor, que recapitulan total o parcialmente las alteraciones moleculares del tumor. Los ácidos nucleicos presentes en el plasma se encuentran como parte de los exosomas o bien como ADN libre circulante (ADNlc) que se derivan de células tumorales apoptóticas o necróticas. Esta última opción es la más utilizada para la detección molecular. El estudio de los ácidos nucleicos circulantes de las neoplasias sólidas está limitado en algunos casos por la baja proporción de moléculas liberadas por la lesión maligna en el torrente sanguíneo, conocidas como ADN tumoral circulante (ADNct), y por la presencia de ADN circulante de células normales que puede confundir la detección del ADN celular maligno por parte de la NGS. En este sentido, uno de los principales factores de confusión puede ser la presencia de ADNct del gran compartimento hematológico. En individuos aparentemente sanos, durante el envejecimiento se produce una expansión clonal de las células hematopoyéticas, lo que se conoce como hematopoyesis clonal (HC) y es identificable a partir de las mutaciones encontradas en la población celular expandida. Aunque muchas de estas mutaciones se producen en genes que no se han descrito con frecuencia en tumores sólidos, como DNMT3A o TET2, las mutaciones asociadas a la HC también se han descrito en genes clínicamente relevantes como TP53 o KRAS. Además, se ha informado que la mayor parte del ADN circulante en el plasma proviene del compartimento hematológico, incluyendo las células hematopoyéticas de la médula ósea.

Razavi y sus compañeros de trabajo se propusieron establecer un protocolo que pudiera discernir entre las mutaciones del tumor y las vinculadas a la HC. Desarrollaron lo que llamaron un ensayo de secuenciación de alta intensidad, con una profundidad de secuenciación extremadamente alta, usando un enfoque dirigido (> 60.000×) y estrategias bioinformáticas refinadas para filtrar los errores en los datos de secuenciación. Analizaron 124 pacientes con cáncer metastásico, incluyendo cáncer de mama, cáncer de pulmón no microcítico y cáncer de próstata. En todos los casos, el análisis de secuenciación se realizó en tejido tumoral compatible, ADNlc y glóbulos blancos (GB). Además, se secuenciaron muestras de ADNlc y glóbulos blancos de 47 individuos sin cáncer para evaluar la presencia de mutaciones relacionadas con la HC.

Los autores mostraron que la mitad de las mutaciones identificadas en el ADNlc de los pacientes con cáncer se originaron en el compartimento hematológico, ya que también estaban presentes en la población de glóbulos blancos, probablemente como resultado de la HC, y por lo tanto no eran derivadas del tumor. Este nuevo enfoque confirma las observaciones anteriores de que las mutaciones relacionadas con la HC están presentes en el ADNlc en individuos aparentemente sanos, así como en pacientes con cáncer. Por lo tanto, en estudios clínicos y aplicaciones futuras, será necesario secuenciar la fracción leucocitaria de un individuo para poder atribuir adecuadamente las mutaciones en su ADNlc a los tumores. Al proporcionar una estrategia para discriminar las alteraciones genómicas tumorales del ruido de fondo generado por la HC, Razavi y sus colegas proporcionan datos relevantes que conducen hacia este objetivo (figura 1). Además, este enfoque sensible permite la detección de mutaciones subclonales dentro del tumor que pueden tener un papel importante en el seguimiento de los pacientes y en la monitorización de la dinámica clonal.

Figura 1. Secuenciación ultraprofunda del ADN libre circulante (cfDNA) y del material genético de glóbulos blancos emparejados para identificar el origen de la variante en un paciente oncológico representativo.

Los paneles verdes representan mutaciones somáticas relacionadas con el cáncer. Los paneles púrpuras indican mutaciones hematopoyéticas clonales detectadas en los glóbulos blancos (GB) que se sustraen mediante análisis bioinformático del perfil de mutaciones del ADN libre circulante total (cfDNA) (el panel con cuadrados verdes y púrpuras mezclados) para discriminar las mutaciones relacionadas con el cáncer de las mutaciones no relacionadas con el cáncer (hematopoyesis clonal). Este es un paso crítico hacia el uso apropiado de la biopsia líquida como base para las decisiones clínicas en pacientes con cáncer.

Los hallazgos de los autores son de suma importancia en varias situaciones clínicas en las que el análisis del ADNlc puede ser una herramienta útil en el flujo de trabajo para el manejo de pacientes, como por ejemplo, la evaluación de biomarcadores predictivos y pronósticos, el seguimiento de la resistencia a los medicamentos y la detección de la enfermedad mínima residual (EMR) después de la resección de un tumor. En un futuro próximo, estas tecnologías podrían extenderse al cribado de cáncer en individuos sanos. El enfoque de los autores es de especial relevancia para la implementación clínica de la biopsia líquida para detectar la EMR y en el cribado del cáncer, donde los falsos positivos debidos a la hematopoyesis clonal pueden dar lugar a conclusiones erróneas y perjudiciales. También es de especial relevancia para la detección de la carga mutacional tumoral (CMT), donde la hematopoyesis clonal puede dar un resultado falso de alta CMT.

Por otro lado, aún está por determinar el riesgo patológico asociado a la hematopoyesis clonal. Existe evidencia que sugieren un mayor riesgo de neoplasias mieloides, incluyendo síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide aguda, así como un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular, accidente cerebrovascular isquémico e insuficiencia cardiaca. Por lo tanto, se justifica la realización de futuros estudios para determinar la utilidad de la HC como herramienta independiente de toma de decisiones clínicas.

Por último, hay que tener en cuenta que las mutaciones somáticas no tumorales no se limitan al compartimiento hematopoyético y pueden surgir en otros tejidos envejecidos, como se ha descrito para la endometriosis y el aneurisma. Actualmente se están caracterizando otras estrategias para determinar el origen del ADNlc, incluyendo el perfil de metilación y el patrón de fragmentación diferencial mediante el posicionamiento nucleosomal o las alteraciones epigenómicas en los sitios de unión a factores de transcripción, lo que en el futuro podría permitir la identificación precisa del ADNlc en la biopsia líquida.

En conclusión, para contextualizar con precisión los hallazgos moleculares cuando se aplican los enfoques de secuenciación profunda, se requerirá la secuenciación simultánea de leucocitos y muestras de tejido tumoral, si están disponibles, para determinar los orígenes de las mutaciones detectadas por la biopsia líquida e interpretar su valor clínico apropiadamente. 

Fuente bibliográfica

High-accuracy liquid biopsies

Beatriz Bellosillo & Clara Montagut

Clinical Oncology Department, Hospital del Mar, IMIM-CIBERONC, Barcelona, Spain

Nat Med 25, 1820–1821 (2019)

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