Seguimiento a las drogas

Históricamente, el conocimiento de los medicamentos y sus objetivos se ha quedado muy por detrás de la administración medicamentosa a los pacientes, a menudo con resultados dañinos o incluso mortales. Varios avances sugieren que la identificación y validación de las interacciones fármaco-diana se pueden hacer con mayor facilidad, eficiencia y precisión. Una nueva estrategia de libre marcaje (que utiliza el fármaco nativo sin necesidad de identificación química o modificación) ideado por Daniel Martínez-Molina y colegas (Science 2013; 341:84-7), conocido como el ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA), es capaz de medir la unión fármaco-objetivo dentro de las células, facilitando el análisis de variables tales como el transporte, la activación, distribución tisular, especificidad de la diana y resistencia.

Cuando las proteínas en su conformación nativa son sometidas a condiciones de desnaturalización, incluyendo calor, pierden rápidamente sus estructuras de orden superior, lo que conduce al estado desplegado (figura 1). El desplegamiento de la proteína, se acompaña típicamente por cambios en las propiedades físicas (o biofísicas), que pueden ser disuadidos por la presencia de un ligando unido (o fármaco). Estas modificaciones incluyen el aumento en el tamaño de los agregados de la proteína o su afinidad por los colorantes polares que son la base para los ensayos térmicos de dispersión de luz y aquellos basados en fluorescencia - diferencial de dispersión de luz estática y fluorimetría diferencial de barrido, respectivamente - que son capaces de identificar ligandos (u otras condiciones) que aumentan la termoestabilidad de una proteína. Debido a que ambos métodos son independientes de la función proteica y son de alto rendimiento, han sido útiles en la biología estructural y la detección de drogas, pero se han limitado al análisis de proteínas puras.

En el fondo, el CETSA es una interpretación ingeniosa de ensayos de desnaturalización térmica (figura 1). Las alícuotas de lisados de células de mamífero cultivadas se tratan con un fármaco versus un control (o, alternativamente, se obtienen las células tratadas o tejidos de ratones tratados con un fármaco versus un control) y se calientan a varias temperaturas, lo que resulta en la formación, al aumentar la temperatura, de agregados de proteínas insolubles y desnaturalizados, que luego son convenientemente separados de sus homólogos solubles por centrifugación (después de la lisis celular). Los niveles de la proteína diana que quedan en la fracción soluble a cada temperatura se evalúan por medio de transferencia Western. La intensidad de la banda relativa de la proteína diana soluble restante se representa según la temperatura, y la temperatura de fusión de la proteína (en donde el 50% de la proteína se desnaturaliza) se deriva de la proteína libre frente a la que está unida al fármaco (figura 1), con la diferencia semicuantitativa correspondiente a la afinidad de la interacción molecular. La belleza de este método es que puede trabajar con mezclas complejas de proteínas (por ejemplo, células y tejidos enteros) en la vida real, incluyendo muchos escenarios clínicamente relevantes, sin que se requiera la generación de proteínas puras.